ボルバキアのスケーラビリティの強化

寄生虫とベクター 16 巻、記事番号: 108 (2023) この記事を引用

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3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

細菌の内部共生微生物であるボルバキアのネッタイシマカ集団への侵入は、アルボウイルスの伝播を減らすために使用されている生物防除アプローチです。そのためには、ボルバキアに感染した蚊を大量に放出する必要があります。放鳥はさまざまな技術を使用して行われていますが、蚊の卵と幼虫の餌を含む水溶性カプセルを使用する卵放流は、現場での資源要件を削減できる可能性があるため、魅力的な方法となります。ただし、蚊の適応性に悪影響を及ぼさないようにし、ボルバキアの遺伝子移入の成功を促進するには、このアプローチの最適化が必要です。

我々は、野生型 (WT) およびボルバキア感染 (wMel または wAlbB 株) Ae に対する保存時間と温度の影響を調べました。ネッタイシマカの卵。卵をカプセル内で 18 °C または 22 °C で 8 週間保存し、孵化率、羽化率、ボルバキア密度を測定しました。次に、輸送中に極端な温度にさらされた場合に卵がどのような影響を受けるかを判断するために、卵を 4 ～ 40 °C にさらした後の卵の品質とボルバキアの密度を調べました。

8週間の卵のカプセル化は、対照と比較して、卵の生存率や、結果として生じる成虫の羽化およびボルバキア密度に悪影響を与えることはなかった。卵を4〜36℃の温度に48時間曝露した場合、その生存率とその結果として生じる成体ボルバキアの密度は維持されました。ただし、どちらも 40 °C にさらされると大幅に減少しました。

ボルバキアに感染したAeの生存能力を維持するための時間と温度の限界について説明します。ネッタイシマカの卵をカプセル化した場合、または極端な温度にさらした場合。これらの発見は、野外放出中に高品質の物質のみが利用されることを保証する輸送および保管の制約を提供することにより、大量放出の効率を改善する可能性がある。

デングウイルス (DENV) によって引き起こされるデング熱は 100 か国以上で流行しており、世界人口の約半数が感染の危険にさらされています [1、2、3]。ネッタイシマカは、ジカウイルス (ZIKV)、チクングニヤウイルス (CHIKV)、黄熱ウイルスと同様に、DENV の主要なベクターです [4、5]。これらのウイルス性疾患の有病率は、媒介動物の生息地の拡大 [6、7] と殺虫剤などの現在の予防戦略の失敗により増加し続けています [8]。

その結果、このことが過去 10 年間にわたっていくつかの新しい生物的防除戦略の開発を推進してきました。個体数抑制方法には、化学物質への曝露、放射線照射、または遺伝子組み換えによって不妊化された雄昆虫の放出が含まれます[9、10、11、12]。不妊の雄は野生の雌と交尾して生存不可能な子孫を生み出し、個体数を減らします。メスが子孫を残さないようにする別の方法は、相性の悪いオスを放すことです。この方法は、内部共生細菌ボルバキアを Ae に導入することによって開発されました。ネッタイシマカ。 Aeのとき。ネッタイシマカにボルバキアが感染すると、雄の精子は生殖的に改変され、雄が野生の雌と交尾すると子孫は死ぬようになる[13、14、15、16]。現在の個体数抑制技術はすべて、雄を継続的に放出し、時間の経過とともに個体数を減少させるものです。あるいは、ボルバキアを集団遺伝子移入アプローチに使用することもできます。 Aeのとき。ネッタイシマカはボルバキアを媒介しており、DENV [14、17、18]、ZIKV [19、20]、CHIKV [14、19、21]、黄熱ウイルス [21、22] などのウイルスの伝播の可能性が減少します。このアプローチには、雄と雌の両方のボルバキアに感染したAeの放出が含まれます。ネッタイシマカ。ボルバキアに感染していないメスは、ボルバキアに感染しているオスと交配しても生存可能な卵を産みませんが、ボルバキアに感染しているメスはこの致死性を回復し、生殖上の利点をもたらします。ボルバキアは母性遺伝するため、時間の経過とともにボルバキアが人口全体に広がり、ウイルス感染に抵抗力のある蚊の集団が形成されます。これらの生物的防除方法はすべて、自然個体群と競合する蚊の大量放出に依存しています。したがって、蚊が媒介するウイルスの重大な蔓延に対処するのに十分な規模で、長期的な解決策を提供する生物防除方法を実装するためのツールを用意することは、優先度が高い[23、24、25、26、27]。

蚊を野生に持ち込むには、卵、蛹、または成虫を放す方法が使用されてきました。蛹放出装置は蛹を水中に保持して保護し、蛹が出現した成虫を保護します。幼虫とは異なり、蛹は食物を必要としないため、人生の蛹の段階で放出することは有益です[28、29]。ただし、蛹の期間は約 24 時間しか続かないため、一斉に同期した発育を達成することは非常に困難です。成体の放鳥には通常、成体を通気性のあるプラスチックチューブに入れ、低速走行（時速 30 ～ 35 km）の乗り物または徒歩から手動で放す方法が含まれます [30]。成虫の空中放出は、無菌昆虫技術との関連で研究されており、これには、最大 50,000 匹の蚊を貯蔵し、低温と投与量を維持し、促されたときに蚊を排出する特殊な放出機構が含まれます [31,32,33]。空中放出は運用コストを大幅に削減します。ただし、特定の気候条件や非公式居住地など、すべての地理的および社会的状況において実用的ではないため、地上放出が依然として重要であることを意味します。蛹と成虫の地上放流には蚊の飼育と梱包に多大な資源が必要であることを考えると、卵放流は魅力的な代替手段となります。ボルバキアに感染したAeの放出。ネッタイシマカの卵には、施設内または地域拠点での卵の生産と、十分な幼虫の餌が入った水の入った容器に入れて野外に卵を放流する場所への輸送が含まれます。卵の放出は、Oxitec の Friendly™ カプセル法、遺伝子ドライブ、その他の遺伝子組み換え蚊の放出など、野外放出前に性選別を必要としないあらゆる生物防除方法に適用できます [34、35]。この方法は、Ae でのボルバキアの確立に成功しました。ネッタイシマカは、オーストラリアのクイーンズランド州やインドネシアのジョグジャカルタの一部などに生息しています[36、37、38]。しかし、卵の生存能力を維持しながら、卵を幼虫の餌と等分して分配することは、一斉に困難である。したがって、卵の包装と配送方法を改善するために、水溶性カプセルに幼虫の餌を含む卵をカプセル化する方法が開発されました[39]。

幼虫の餌で卵をカプセル化し、保管時間を設けずに孵化させても、孵化率、羽化率、成体の羽の長さ、ボルバキアの密度には影響を与えない[39]。しかし、長期間の保存時間と温度がカプセル化された卵に及ぼす影響はまだ不明です。研究では、ボルバキアに感染したカプセル化されていない卵を長期間保存すると、ボルバキアのない卵よりも早く卵の生存率が低下することが示されています[40,41,42,43,44,45,46,47,48]。さらに、卵の保存温度が低い (< 14 °C) と高い (周期的に 22 ～ 30 °C) の両方が卵の生存率に悪影響を与えることが示されています [48, 49]。したがって、カプセル化によってこの影響がさらに悪化するかどうか、またどの温度でボルバキアに感染した卵が生存できるかを判断することが重要です。

この研究では、保管時間または温度がカプセル化された卵の適応度測定に影響を与えるかどうか、およびボルバキアに感染した卵（wMelおよびwAlbB - 野外放出で利用されている現在の株[23、50]）がWT卵と比較して異なる影響を受けるかどうかを調査します。次に、適切な卵の輸送とリスク管理戦略を提供するために、極端な高温および低温への曝露が卵の生存率とボルバキアの密度に及ぼす影響を調査します。我々は、カプセル内に卵を保管しても、対照の保管方法と比較して、卵の生存率、羽化率、ボルバキア密度に悪影響を及ぼさないことを報告しています。私たちは、低温にさらされた後も卵の生存率は非常によく維持されるが、温度が 40 °C を超えると卵の生存率とボルバキア密度が低下する可能性があることを示しました。

この研究では、オーストラリアの 3 つの蚊株、WT、wMel および wAlbB に感染した Ae を使用しました。ネッタイシマカ。これらのコロニーの確立は、Flores et al. によって以前に記載されています。 [51]。これらの実験を開始する前に、wMel 系統と wAlbB 系統をオーストラリアの WT 蚊 (100% WT 雄) にさらに 3 世代戻し交雑して、系統間で発生した可能性のある遺伝的相違を軽減しました。さらに、部分的な戻し交配は、各世代の WT 雄の 10% でその後の世代ごとに行われました。実験は、完全な戻し交雑の完了後すぐの 1/8 世代で行われました。コロニーは、26 °C、70% 相対湿度 (RH)、12 時間:12 時間の明暗サイクルで気候制御された昆虫庫内の標準的な実験室条件下で維持されました。

幼虫の餌は、Puggioli らの記載に従って、35% の牛レバー粉末 (Now Foods、米国)、50% のマグロ粉 (Ridley Aqua Feeds、オーストラリア)、および 15% のビール酵母 (Now Foods、米国) を一緒に徹底的に粉砕して混合することによって調製されました。。 [52]。流動食バージョンは、固体成分を逆浸透 (RO) 水と混合して 7.51% スラリーを形成することによって調製されました。食品成分は 4 °C で保存されました。実験用の卵を生成するための標準的な飼育条件では、エビウエハース (Tetra®、米国) が使用され、室温で保存されました。

各実験では、新鮮な卵を収集するために蚊を一世代飼育しました。これを行うために、卵を真空孵化させ、200匹の幼虫を3リットルのRO水に入れ、液体の幼虫飼料またはエビのウエハースを毎日与えました。蛹化が 50% を超えた時点で、各容器を 24.5 × 24.5 × 24.5 cm または 20 × 20 × 30 cm のケージに移し、成虫の蚊にスクロース溶液 (10% スクロース、0.4% プロピオン酸) を与えました。羽化後 5 ～ 6 日後に、人工給餌器を介して成体メスに血液ミールを与えました。人間の血液は、オーストラリア赤十字社 (供給協定 22-05VI-04) または人間のボランティア (モナシュ大学人間研究倫理許可 27690) によって提供されました。濾紙を敷き、半分を水で満たしたカップを産卵用に用意した。吸血の96時間後、蚊の卵が付着した紙基材をペーパータオルと布の層の間に2時間押し付けて乾燥させ、その後ペーパータオルを敷いた浅いトレイで翌日かけてゆっくり乾燥させ、26℃で保管したおよび75±5%RH。

卵カプセルを調製するために、150 個の生存可能な卵を手動で数え、小さな絵筆を使用して紙の基材からサイズ 00 の水溶性ヒドロキシプロピルメチルセルロース (HPMC) カプセル (The Capsule Guy、オーストラリア) に優しく刷毛で塗りました。カプセルの調製前に、カプセルあたりの生存可能な卵の数が正確に定量されるように、すべての蚊の系統からの卵に対して孵化率試験が実施されました。次いで、カプセルに285 mgの幼虫の餌と110 mgの活性炭をトッピングしました。カプセルが完全に満たされていることを確認するために、活性炭が充填剤として使用されました。各実験では、条件および孵化週ごとに 5 つの複製カプセルを準備しました。食餌専用カプセルを調製し、カプセル化されていない対照群（すなわち、紙基材上の卵）の幼虫の餌として使用した。対照グループの卵は、卵を産む紙基材を約 150 個の生存可能な卵のグループに切断することによって準備されました。

すべての保管条件において、特に指定がない限り、卵は 75 ± 5% RH および 22 °C で維持されました。温度実験では、カプセルまたは紙基材に入れられた卵を 18 °C または 22 °C で保存しました。極端な温度実験では、紙基材上の卵 (カプセル化されていない) を 4 °C、12 °C、26 °C、36 °C、または 40 °C で保存しました。温度と湿度は、飽和食塩水が入った実験室用インキュベーター (Thermoline L + M) 内に卵を保管することによって制御され、hygrochrons (iButton®) を使用して追跡されました。

カプセル内または食品カプセルを備えた紙基材上の卵の孵化率を測定するために、Adobe Photoshop カウントツールを使用してグループあたり 150 ～ 200 個の卵を写真撮影および定量化し、300 ml の RO 水の入ったカップに浸しました。卵を浸してから 48 時間後に、個々の容器内の幼虫の数を数えました。幼虫を数えた後、対応する容器に戻し、成虫まで成長させた。孵化率は、容器ごとに幼虫を産んだ卵の割合として計算されました。

羽化率は孵化後 14 日および 16 日後に測定され、コンテナごとに成虫として羽化した幼虫の割合として計算されました。

羽化から6日後、成体の雌を収集し（1グループあたり24～40匹の雌）、96ウェルプレートに個別に配置し、スカッシュバッファー（10 mM Tris、pH 8.2; 1 mM EDTA; 50 mM NaCl）を添加した50μl中でホモジナイズしました。２５μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）および２ｍｍガラスビーズ（ＰａｃｉｆｉｃＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｏｄｕｃｔｓ）を使用した。サンプルを 3000 rpm で 3 分間遠心分離して清澄化し、サーモサイクラーでインキュベートしました (56 °C で 5 分間、続いて 98 °C で 5 分間)。蚊のホモジネートを、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって再度清澄化し、次いで上清をＡＥ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して１０倍に希釈した。総相対ボルバキア密度は、三重定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) によって推定されました。 qPCR 反応は、5 μl の 2 × LightCycle 480 プローブマスター反応ミックス、2.5 μM プライマー、10 μM の各プローブ (ボルバキア表面タンパク質 [wsp]、リボソームタンパク質 S17 [RpS17] およびアンキリンリピートドメイン) を含む総容量 10 μl で実行されました。 wAlbB [wAlbB141] に含まれるタンパク質 (DEJ70_01140)) および 3 μl に希釈した (1:10) 成人ホモジネート (プローブおよびプライマー配列については追加ファイル 1: 表 S1 を参照) [53、54]。サイクリングは、LightCycle 480 II (Roche) を使用して、95 °C で 5 分間を 1 サイクル、続いて 95 °C で 10 秒、60 °C で 15 秒、および 72 °C で 1 秒の増幅サイクルを 45 回実行しました。 qPCR データを分析するために、デルタ Ct 法 [55]、NE = 2Cq (参照)/2Cq (標的) を使用して正規化発現 (NE) を計算しました。ここで、RpS17 は参照遺伝子、wsp または wAlbB141 は標的遺伝子です。

データ分析は R v 1.4.1717 を使用して行われ、GraphPad Prism v 9.2 を使用して視覚化されました。正規性は Shapiro-Wilk 検定を使用してチェックされ、診断プロットと残差シミュレーションプロットを使用して仮定がチェックされました [56]。一般化線形モデル (GLM)、Kruskal-Wallis H 検定または Mann-Whitney U 検定 (ノンパラメトリックデータ) を実行しました [57,58,59]。モデリングの後に ANOVA を行って治療効果を比較しました (パラメトリックデータ) [60]。有意な相互作用が特定された場合は、ペアごとの比較に Tukey の P 値調整法を使用しました [61]。各実験で 2 つの生物学的複製を実行し、複製データが互いに大きく異なるかどうかを評価して、複製を個別に分析するか一緒に分析するかを決定しました。図 1 および追加ファイル 1: 図 S1 と図 2 および追加ファイル 1: 図 S2 は独立して分析され、図 1 と図 2 は独立して分析されました。図３および４は、反復変数を含めて一緒に分析された２つの独立した実験の代表である。統計出力の詳細は、追加ファイル 2: データセット S1 に記載されています。

22 °C で保存するために卵をカプセル化しても、対照と比較して、卵の生存率、成虫の羽化、またはボルバキア密度への影響が悪化することはありません。 WT、wMel、および wAlbB に感染した卵を、幼虫の餌とともに水溶性カプセルに包装するか、対照として紙基材上に放置し、22 °C で 0、2、4、6 または 8 週間保存しました。 a 孵化率、b 羽化率、c ボルバキア密度を測定しました。各データポイントは、カップ 150 匹の蚊 (孵化と羽化)、または 1 匹の蚊 (ボルバキア密度) を表します。ボルバキア密度グループごとに 24 ～ 40 匹の蚊がサンプリングされました。孵化率データは ANOVA によって分析され (有意ではありません [ns])、データは平均値と標準誤差として示されています。羽化率とボルバキア密度データは一般化線形モデルによって分析され、データは四分位範囲の中央値として表示されます。

18 °C で保存するために卵をカプセル化しても、22 °C と比較して卵の適合性は向上しません。卵は、幼虫の餌とともに水溶性カプセルに詰めるか、対照として紙基材の上に放置し、18 °C または 22 °C (対照) で 0、2、3、4、5、6、7 または 8 週間保存しました。 a 孵化率 b 羽化率 c ボルバキア密度を測定しました。各データポイントは、カップ 150 匹の蚊 (孵化と羽化)、または 1 匹の蚊 (ボルバキア密度) を表します。ボルバキア密度グループごとに 24 ～ 40 匹の蚊がサンプリングされました。孵化率データは、ANOVA に続いて Tukey の多重比較検定 (有意差なし [ns]、P < 0.01**) によって分析され、データは平均値と標準誤差として表示されます。二次有意性バーは、時間の経過に伴う孵化率を比較します。羽化率とボルバキア密度データは、一般化線形モデルとクラスカル-ウォリス H 検定 (P < 0.05*、P < 0.001***) によって分析され、データは四分位範囲の中央値として表示されます。出現率の二次有意性バーは、時間の経過に伴う変化を示します。ボルバキア密度の二次有意性バーは、第 8 週を対応する第 0 週の対照と比較します。

低い卵保存温度が卵の生存率と成体のボルバキアの密度に及ぼす影響。紙基質上の WT、wMel、および wAlbB に感染した卵を、26 °C、12 °C、および 4 °C で 0、8 または 48 時間保存しました。 a〜c 孵化率とデ・ボルバキア密度を測定した。これらのデータは、2 つの実験反復を組み合わせたものを表しています。各データポイントは、150 ～ 300 匹の蚊 (孵化率) または 1 匹の蚊 (ボルバキア密度) を含む 3 カップの平均を表します。ボルバキア密度グループごとに 80 匹の蚊がサンプリングされました。孵化率データは、各グループ内の経時的な孵化率の変化を比較するために、ANOVA とそれに続く Tukey の多重比較検定 (有意ではない [ns]) によって分析されました。データは平均値と標準偏差として表示されます。ウォルバキア密度データは、クラスカル-ウォリス H 検定およびウィルコクソン符号順位検定 (P < 0.05*、P < 0.01**、P < 0.0001****) によって分析され、データは四分位範囲の中央値として表示されます。

高い卵保存温度が卵の生存率と成体のボルバキアの密度に及ぼす影響。紙基質上の野生型（WT）、wMel、および wAlbB に感染した卵を、26 °C、36 °C、および 40 °C で 0、8 または 48 時間保存しました。 a〜c 孵化率と d〜e ボルバキア密度を測定しました。これらのデータは、2 つの実験反復を組み合わせたものを表しています。各データポイントは、150 ～ 300 匹の蚊 (孵化率) または 1 匹の蚊 (ボルバキア密度) の 3 カップの平均を表します。ボルバキア密度グループごとに 80 ～ 115 匹の蚊がサンプリングされました。孵化率データは、ANOVA とそれに続く Tukey の多重比較検定 (有意差なし [ns]、P < 0.01**、P < 0.0001****) によって分析され、各グループ内の経時的な孵化率の変化を比較しました。データは平均値と標準偏差として表示されます。ボルバキア密度データは、クラスカル-ウォリス H 検定およびウィルコクソン符号付き順位検定によって分析され、データは四分位範囲の中央値として表示されます。

蚊の適応度に対する卵のカプセル化の影響を評価するために、WT、wMel、およびwAlbBに感染した卵をカプセル内に保管しました。我々は、カプセル化、ボルバキア感染、8週間の保存期間が静止卵の寿命に及ぼす影響と、その結果として生じる成虫羽化率とボルバキア密度を比較した。紙基材上の卵から孵化した各蚊系統（対照）とカプセル化された卵を比較すると、孵化率は大きな影響を受けませんでしたが、保管時間の影響を受け、3 つの蚊系統すべてで卵の生存率が時間の経過とともに減少しました（ANOVA; 孵化率: カプセル化）、F(1,148) = 9.1727、P = 0.7791;孵化率: 保管時間、F(1,148) = 31.9372、P < 0.0001****) (図 1a)。繰り返しの実験により、カプセル化された場合、wMelおよびwAlbBに感染した卵の孵化率が小さいが有意に減少することが示されました（追加ファイル1：図S1a）。有望なことに、8週間の保存まですべてのグループで羽化率は平均75％を超えて高いままであり、カプセル化による悪影響は受けませんでした（GLM;すべての比較でP > 0.05）（図1b）。繰り返し実験でも同様の傾向が示されましたが、カプセル化に関係なく、WT対照卵とwAlbB感染卵では8週目の羽化の大幅な減少が観察されました（追加ファイル1：図S1b）。羽化した成虫のボルバキア密度を分析したところ、時間の経過とともに密度はわずかに変化しましたが（wAlbB は一般に増加し、wMel は減少するか一定のまま）（GLM; ボルバキア密度：保存時間、P = 0.0076**）、カプセル化はボルバキアに悪影響を及ぼさないことがわかりました。密度（GLM;ボルバキア密度：カプセル化、P = 0.159）（図1c）。繰り返し実験でもこれが実証されました（追加ファイル1：図S1c）。まとめると、これらの実験は、卵のカプセル化が孵化率に対する保管時間の悪影響を悪化させず、最長8週間保管されたカプセル化された卵から生成される蚊の成虫の羽化やボルバキア密度にも悪影響を及ぼさないことを示しています。

次に、Lau らの結果に従って、18 °C の保存温度がカプセル化された卵の寿命と成体の体力に及ぼす影響を評価しました。 [48] は、ボルバキアに感染した卵を低温で保存すると卵の寿命が延びる可能性があることを示した。 wMel は野外放流で最も広く使用されているボルバキア株であるため、この実験では wMel に焦点を当てました。最初に、紙基質対照または各温度で保管されたカプセルからの卵の孵化率を比較しました。 18 °C では、カプセル化された卵の孵化率はコントロールよりも大幅に低かった (Tukey の多重比較; 18 °C、コントロール: カプセル、Z = − 3.192 P = 0.0014**)。一方、22 °C では、カプセル化された卵の孵化率はコントロールとカプセル化された卵は互いに有意な差はありませんでした（Tukeyの多重比較; 22°C、コントロール：カプセル、Z = − 1.118、P = 0.2634）（図2a）。温度の影響を考慮すると、コントロール卵とカプセル化卵の両方で、22 °C と比較して 18 °C で保存した場合の孵化率がわずかに高くなりました (Tukey の多重比較; コントロール、18 °C: 22 °C、Z = 3.521 P = 0.0004***; カプセル、18 °C: 22 °C、Z = 2.124、P = 0.0337*)。ただし、これは再現可能な違いであるとはわかりませんでした (追加ファイル 1: 図 S2)。総合すると、これらの結果は、卵のカプセル化が対照と比較して卵の生存率に悪影響を及ぼさないことを裏付けており、保管温度を 18 °C に下げても卵の生存率に実質的な影響を与えないことを示唆しています。

次いで、幼虫を成虫まで飼育し、羽化およびボルバキア密度を評価した。注目すべきことに、8週間の保管後に羽化の減少が観察されました。これは図1bでは見られませんでしたが、繰り返し実験（追加ファイル1：図S1b）で観察されました。これはおそらく卵と食品の品質のバッチ変動によるものです。。事後分析により、経時的に観察された成虫羽化の減少は、22℃で保存した対照卵で最も顕著であったが、カプセル化や保存温度には影響を受けなかったことが明らかになった（GLM; 羽化: カプセル化、P = 0.6574; 羽化: 温度、P = 0.2738) (図 2b)。全体として、羽化率は、22 °C と比較して 18 °C での卵のカプセル化または保管の影響を受けませんでした。成体のボルバキアの密度は、グループ間で変動しましたが、卵の保管期間の延長に伴う明確な変化の傾向は示されませんでした（図2c）。最も注目すべき点は、どのグループでもボルバキアの損失が観察されなかったこと（野外放流におけるボルバキアの母子感染を維持するための重大な懸念）、莢膜がボルバキア密度の変動要因ではなかったことである（クラスカル-ウォリスH検定; ボルバキア密度: 莢膜、H = 1.164、P = 0.2806)。

蚊の卵は、地元の放散場所に大規模生産の能力がない場合、航空貨物で生産施設から放流場所に輸送されます。卵を輸送する際、周囲温度が極端に高温または低温に達する可能性があり、卵の生存率やボルバキアの密度に影響を与える可能性があります。したがって、卵が生存可能な温度範囲を理解し、ボルバキアに悪影響を及ぼさないことが、高い品質管理を確保するために重要です。これをテストするために、4 ～ 40 °C の範囲の温度で紙の基材上に卵を保存し、8 時間または 48 時間の保存後に孵化し、卵の生存率を評価しました。低温 (4 °C および 12 °C) は、WT の卵の生存率に悪影響を与えませんでした (Tukey の多重比較、0 時間: 48 時間; 12 °C、Z = − 2.051、P = 0.1002; 4 °C、Z = − 1.638、P = 0.2295）、wMel 感染（Tukey の多重比較、0 h: 48 h; 12 °C、Z = − 0.443、P = 0.8976; 4 °C、Z = 0.071、P = 0.9973）または wAlbB 感染卵 (Tukey の多重比較、0 時間: 48 時間; 12 °C、Z = − 0.299、P = 0.9519; 4 °C、Z = − 1.5 P = 0.2909) (図 3a)。その後、幼虫を 26 °C で飼育し、成虫をサンプリングしてボルバキア密度を測定しました。 wMel 密度は低温によってマイナスの影響を受けました (Kruskal-Wallis H 検定; wMel ボルバキア密度: 保管温度、H = 17.614、P = 0.0002***) 一方、wAlbB はマイナスの影響を受けず、代わりに密度がわずかに増加しました (Kruskal -Wallis H 検定; wAlbB ボルバキア密度: 保管温度、H = 7.7577、P = 0.0208*) (図 3d–e). 卵を 4 ℃で保管したときに wMel 損失が発生した例が 2 件 (160 サンプル中) ありました。 ℃（図３ｄ）。

次に、卵を36℃と40℃の高温で保存しました。 WT および wMel に感染した卵の生存率は、卵を 36 °C に曝露した場合でも維持されましたが、wAlbB に感染した卵の生存率はわずかに減少しました。 3 つの系統はすべて、40 °C で 48 時間保存すると生存率が大幅に低下しました (Tukey のペアワイズ比較、40 °C、0 時間: 48 時間; WT、Z = − 7.36、P < 0.0001****; wMel、Z = − 9.894、P < 0.0001****、wAlbB、Z = − 3.876、P = 0.0003***) (図 4a–c)。しかし、wAlbB に感染した卵の生存率は、反復実験間で一貫性がありませんでした。両方の実験反復では、36 °C で保管した場合 48 時間後に生存率が大幅に低下することが示されましたが、一方の実験反復では、40 °C は卵の生存率に重大な影響を与えませんでした。 36 °C で保存された卵から出現した成体のボルバキア密度には、ほとんどまたはまったく影響が見られませんでした (ウィルコクソンの符号付き順位検定、36 °C ボルバキア密度、8 時間: 48 時間; wMel、Z = − 3.0538、P = 0.0023*) *; wAlbB、Z = − 1.4402、P = 0.1498）（図4d）。しかし、卵を40℃で48時間保存すると密度は大幅に減少し、wMel感染成人とwAlbB感染成人の大部分でほぼ完全なボルバキアの喪失が観察された（ウィルコクソンの符号順位検定、40℃のボルバキア密度、8 h：48時間; wMel、Z = − 8.2106、P < 0.0001****; wAlbB、Z = − 8.2106、P < 0.0001****）（図4e）。これらのデータは、卵が40℃以上の温度に48時間さらされた場合、生存率が大幅に低下し、出現した成虫がボルバキアに感染している可能性が低いため、廃棄する必要があることを示しています。

現在までに、ボルバキアはエでの確立に成功しています。 1,000万人を蚊が媒介する病気から守るために、世界中の都市にネッタイシマカの個体群を配置している[50]。これはデング熱のリスクにさらされている世界人口のほんの一部であり、29 億 2,000 ～ 39 億 7,000 万人と推定されています [1]。ボルバキアの遺伝子移入、遺伝子ドライブ、遺伝子組み換えなどのプログラムは規模を拡大して新しい地域で活動するため、蚊を大量に放出するためのコスト削減と資源効率の高い方法が必要です。卵の段階で蚊を放すことは、蚊を施設外で生産して放鳥エリアに輸送できるため、地元の蚊飼育施設が不要になるため魅力的です。さらに、住民を後方および釈放のプロセスに参加させることで、地域社会の関与を促進するために使用することもできます [36]。この方法は、オンサイト施設の設立に伴う財政的および規制上のハードルを克服します。ただし、卵の品質とボルバキア感染を維持することは、導入を成功させるために不可欠です[62]。したがって、卵と食品のカプセルは、卵の放出の拡張性を向上させる機会を提供します。私たちの研究では、卵の大量流通を助ける方法として、カプセル内での卵の長期保存をテストしました。

有望なことに、我々は、卵のカプセル化がWT、wMel、またはwAlbBに感染した卵の生存率に悪影響を及ぼさないことを発見した。時間の経過とともに、ボルバキアに感染した系統と未感染の系統では卵の生存率が低下しました。ただし、カプセル化によってこの損失が悪化することはありませんでした。ボルバキアに感染した卵はWTよりも早く生存能力を失うことを証明する広範な文献がある[40,41,42,43,44,45,46,47,48]。なぜこれが起こるのかはまだ明らかではありませんが、カプセル化が時間の経過とともに卵の生存率にさらに影響を与えることはないことを知っておくことが重要です。羽化率とボルバキア成虫の密度も、カプセル化や保存時間の影響を受けませんでした。全体として、ボルバキアの感染状態に関係なく、カプセル化された卵は体力の低下の影響を受けにくいということはありませんでした。

次に、保管温度を 18 °C に下げると、22 °C と比較してカプセル化された卵の生存率と成体の体力が向上するかどうかをテストしました。これは、ある研究[63]でWTネッタイシマカの卵の保存に定義された20～26℃、相対湿度70～85%の理想的な範囲よりも低いですが、他の研究では、より低い卵の保存温度は、より高い卵の保存温度と比較した場合、卵の寿命を延ばすことができることを示しています温度[48、64]。 wMel に感染した卵の生存率は、保管温度を 18 °C に下げても影響を受けないことがわかりました。卵の保存による悪影響は、特に 22 °C で保存された卵では時間の経過とともに増加しましたが、これはカプセル化とは無関係でした。その結果、水生蚊の健康に不適切な劣悪な水環境につながる可能性のある餌の過剰が潜在的に原因で、出現率も時間の経過とともに低下しました[65]。ボルバキアの密度はカプセル化と時間の影響を受けませんでした。ここでは、18 °C での保存が卵の生存率に及ぼす影響には多少の一貫性がありませんでしたが、ボルバキアに感染した Ae にとって理想的な温度を確立できるかどうかを判断するために今後の研究が行われる可能性があります。ネッタイシマカの卵の長さ。全体として、卵をカプセル化して 18 ～ 22 °C で保存することは、蚊の適応度測定に悪影響を及ぼしませんでした。

放卵の現場での応用では、世界蚊プログラムは、現場での大量生産をサポートできない放流場所に卵を輸送するために航空貨物を利用しており、そのため卵は極端な温度にさらされやすくなります。現在、出荷時の温度は 15 ～ 25 °C に維持されるよう努めています。しかし、卵と一緒に輸送されるデータロガーは、特に出荷時間が最大 5 日間で遠隔地に輸送される場合、温度がこの範囲外に達する可能性があることを示しています [62]。卵の生存率とボルバキアの密度がどのような条件に影響されやすいかを詳細に理解することで、卵ストックが極端な温度にさらされた場合に卵の品質に影響を与える可能性があることをプロジェクト現場に知らせることができます。私たちは、卵を 4 ～ 40 °C に短期間 (48 時間) 曝露した場合の、卵の生存率と、その結果として生じる成体のボルバキア密度に及ぼす影響を測定しました。 4 °C および 8 °C では、卵の生存率と wAlbB 密度は影響を受けませんでした。 wMel 密度は 4 °C で減少しましたが、テストした 160 サンプルのうちボルバキア損失は 2 件のみでした。以前の研究でも、Ae. ネッタイシマカの卵は低温に耐性があり、産み付けられ 16 °C で保存された場合でも高い生存率を維持します [49、67]。高温では、卵の生存率とボルバキアの密度は 36 °C にさらされても影響を受けませんでしたが、40 °C で 48 時間保存すると、重大な悪影響を受けました。卵ストックからボルバキアが失われると、これらの卵はボルバキアの遺伝子移入放出に使用できなくなるため、有害です。実際、ボルバキアのない雌を放すと、個体群内の潜在的なウイルスベクターが増加する可能性があります。 1 つの実験反復における wAlbB を除いて、3 つの系統はすべて同様に挙動しました。例外として、wAlbB は、36 °C で生存率が低下したにもかかわらず、40 °C で生存率を維持しました。これらの結果に一貫性がないことを考えると、wAlbB 卵がこのより高い温度でより優れたパフォーマンスを発揮するかどうかは不明です。 wAlbB は、wMel と比較して高温 (26 ～ 37 °C) で比較的安定であることがわかっています [47、68、69、70]。ロスら。 [69] は、wAlbB の方が温度耐性が高い一方で、最大 38 °C 以上に達するサイクル温度に 1 週間曝露されると、卵の生存率が wMel に感染した卵と同様の割合で減少することを発見しました。成虫の wMel 密度は最高卵保存温度 36 °C 後に減少しましたが、wAlbB はすべての温度下で維持されました (wAlbB の減少が観察される前に卵の生存能力が失われました) [69]。私たちのデータは、wAlbB が急激な高温でドロップアウトしやすいことを示唆しています。 wAlbB はより温度耐性がありますが、Lau et al. [48]は、卵を高温（22～30℃）で6週間以上保存すると、その卵に由来するwAlbBに感染した雌の生殖能力が著しく低下する一方、wMelおよびWTの生殖能力は安定したままであることを示した。この研究では、wAlbB の有意な負の適応度効果は観察されませんでした。しかし、私たちの方法では生殖能力を評価していないため、結果はAeに対するwAlbBの影響を過小評価している可能性があります。ネッタイシマカ。このため、卵を長期間保存する場合には、高温にさらさないように注意する必要があります。これらの実験では卵はカプセル化されていませんでしたが、同様の温度制限が適用される可能性がありますが、カプセル内の温度が周囲温度と異なる場合にはさらなる試験が必要です。これらの結果は、ボルバキアに感染したAeに対する極端な温度曝露の影響についての洞察を提供します。ネッタイシマカの卵は、生存不可能な卵のストックに資源が無駄にならないようにするためのものです。

要約すると、私たちの研究は、幼虫の餌で卵をカプセル化し、8週間以上保存しても、対照の卵の保存方法と比較して、卵の生存率や、結果として生じる成虫の出現とボルバキアの密度に悪影響を及ぼさないことを示しました。さらに、卵の生存率と成体のボルバキアの密度は、4〜36℃で48時間曝露した場合には十分に維持されるが、卵を40℃で8時間以上保存すると、両方とも大幅に低下することを確立しました。昆虫の大量放出生物防除法は、ボルバキア遺伝子移入法による昆虫の適応度の維持に依存しており、さらに高いボルバキア感染率が必要です。カプセルベースの卵の放出により、卵と幼虫の餌を一貫して小分けして野外に輸送することが容易になり、スケールが向上します。蛹や成虫の放鳥と比較して、カプセルは、現場で必要な資源が削減されるため、大量の昆虫の放流に対して物流面でも大きなメリットをもたらします。全体として、この研究により、Ae に影響を与える要因についての理解が深まりました。ネッタイシマカの適応性を調べ、ボルバキアの遺伝子移入の大規模な適用を助ける可能性のある改善された卵放出方法の証拠を提供します。

すべてのデータはテキストおよび追加ファイル内で提供されます。

ヤブカ属

野生型

デング熱ウイルス

ジカウイルス

チクングニアウイルス

相対湿度

逆浸透

ボルバキア表面タンパク質

リボソーム表面タンパク質 S17

正規化された式

一般化線形モデル

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wAlbB141 qPCR アッセイを開発、提供し、プライマー配列を提供してくれた世界蚊プログラムの Peter Kyrylos に感謝します。

この研究は、オーストラリア政府研究訓練プログラム (RTP) 奨学金からの資金提供によって支援されました。

ベクター媒介疾患研究所、モナシュ大学、メルボルン、ビクトリア州、3800、オーストラリア

ミーガン・J・オールマン、キャメロン・P・シモンズ、ヘザー・A・フローレス、ジョアンナ・E・フレイザー

モナシュ大学微生物学部、メルボルン、ビクトリア州、3800、オーストラリア

ミーガン・J・オールマン & ジョアンナ・E・フレイザー

世界蚊プログラム、モナッシュ大学、メルボルン、ビクトリア州、3800、オーストラリア

ヤーシュン・リン、D・アルバート・ジュベール、ジェシカ・アドリー＝クック、マリア・カミラ・メヒア＝トーレス、キャメロン・P・シモンズ

モナシュ大学生物科学部、メルボルン、ビクトリア州、3800、オーストラリア

ヘザー・A・フローレス

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概念化、正式な分析、調査、方法論、プロジェクト管理、検証、視覚化、および原案の作成、レビュー、および編集、MJA。概念化、調査、方法論、監督、執筆、レビューおよび編集、YHL および DAJ。調査と編集、JACとMCMT。方法論、監督、検証、執筆、レビューと編集、CPS、HAF、および JEF。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

Heather A. Flores または Johanna E. Fraser との通信。

これらの実験で使用される卵を生産するために、モナシュ大学人間研究倫理許可番号 27690 に従って成人ボランティアから蚊のコロニーに血液を供給するか、オーストラリア赤十字社との供給協定 22-05VI-04 に基づいてオーストラリア赤十字社から入手した人間の血液を提供しました。ワールドモスキートプログラム株式会社

著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

qPCR のプライマーおよびプローブの配列。図S1。図 1 のデータの繰り返し実験: 22 °C で保存するために卵をカプセル化しても、対照と比較して、卵の生存率、成虫の羽化、またはボルバキア密度に対する影響は悪化しません。図S2。図 2 のデータの実験を繰り返します。18 °C で保存するために卵をカプセル化しても、22 °C と比較して卵の適合性は向上しません。

データセット S1: 統計出力。

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転載と許可

MJ オールマン、YH リン、DA ジュベール他ボルバキアベースのベクター媒介疾患管理の拡張性の強化: 野外放流用のボルバキアに感染したネッタイシマカ卵の保管と輸送の時間と温度の制限。寄生虫ベクター 16、108 (2023)。 https://doi.org/10.1186/s13071-023-05724-1

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受信日: 2023 年 1 月 5 日

受理日: 2023 年 3 月 2 日

公開日: 2023 年 3 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05724-1

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