マウスの内皮レプチン受容体の欠失は食事を促進する

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8276 (2023) この記事を引用

334 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

肥満は内皮機能不全を促進します。 内皮細胞は反応するだけでなく、肥満や代謝機能障害の進行を積極的に促進する可能性があります。 私たちの目的は、内皮および全身の代謝および食事誘発性肥満に対する内皮レプチン受容体 (LepR) の役割を特徴付けることでした。 タモキシフェン誘導性、Tie2.Cre-ERT2媒介の内皮細胞のLepR欠失（End.LepRノックアウト、KO）マウスに、16週間高脂肪食（HFD）を与えた。 体重増加、血清レプチンレベル、内臓脂肪蓄積および脂肪組織の炎症は、肥満End.LepR-KOマウスでより顕著であったが、空腹時血清グルコースおよびインスリンレベル、または脂肪肝の程度には差がなかった。 End.LepR-KO マウスでは、外因性レプチンの脳内皮トランスサイトーシスの減少、食物摂取量の増加、総エネルギーバランスが観察され、脳血管周囲マクロファージの蓄積を伴っていましたが、身体活動、エネルギー消費、呼吸交換率には差がありませんでした。 代謝フラックス分析により、脳または内臓脂肪組織由来の内皮細胞の生体エネルギープロファイルには変化がなかったが、肺から単離された内皮細胞では解糖速度とミトコンドリア呼吸速度が高かったことが明らかになった。 我々の発見は、レプチンの脳への輸送と食物摂取の神経制御における内皮LepRの役割を裏付けており、また内皮細胞における器官特異的な変化ではあるが、全身の代謝ではないことを示唆している。

肥満は心血管の危険因子として確立されており、血管疾患の初期の兆候の 1 つである内皮機能不全 1 としばしば関連しています。 肥満の悪影響は、体重増加に伴う慢性炎症や代謝変化など、多くの要因によって媒介されます。 炎症細胞から放出されるサイトカインに加えて、脂肪細胞によって産生されるサイトカイン（いわゆるアディポカイン）も、肥満に伴う心血管疾患のリスク増加に関与していると考えられています。 とりわけ、肥満は、体重とエネルギー消費の調節に関与するプロトタイプのアディポカインであるレプチンの循環レベルの上昇と関連しています2,3。 神経細胞上に発現するレプチン受容体（LepR）は、食物摂取とエネルギー消費の調節に重要です4。 LepR は、血液脳関門を形成する血管内皮細胞にも存在します5。 内皮細胞上に膜結合型短縮型 LepR を発現するマウスを用いた以前の研究では、レプチン脳組織取り込みの変化と食餌誘発性肥満に対する部分的な耐性が示されました 6、7、8。

レプチンは、満腹因子としての活動以外にも機能を持っています。 これに関連して、末梢血管の内側を覆う内皮細胞も LepRs9 を発現します。 実験研究および臨床研究により、レプチンは内皮機能不全 3 およびその他の心臓血管病理の病態生理学に関与していると考えられています 10,11。 我々は以前、内皮細胞上のLepRを欠損したマウスが、レプチン抵抗性の肥満マウスの血管表現型を模倣した血管表現型を示すことを報告した12。 これらのマウスでは、高脂肪食の給餌に反応して、より顕著な内臓脂肪蓄積が観察されました。 このことや他の最近の実験的証拠は、内皮細胞が肥満に反応するだけでなく、全身のエネルギー恒常性と肥満の進行にも積極的な役割を果たしている可能性があることを示唆しています13、14、15。 しかし、この概念を検討した研究はほとんどなく、メカニズムとメディエーターは明らかになり始めたばかりです16。 この研究では、内皮細胞における LepR の遺伝的欠失がマウスの代謝表現型を変化させ、高脂肪食 (HFD) 食誘発性肥満の発症に積極的に寄与するという仮説を検討しました。

内皮細胞の LepR を誘導的に欠失させたマウス (End.LepR ノックアウト、KO) を以前に作製し、損傷に対する血管 12 または心臓 17 の反応を調べました。 ゲノム DNA の PCR 分析により、脳または内臓 (VAT) および皮下 (SCAT) などの体重制御に関与する臓器において、Tie2.ERT2-Cre を介したフロックス化 LepR 遺伝子 (LepR デルタまたはΔとして表示) の欠失が誘導されることが実証されました。 ）脂肪組織だけでなく、小腸や肺などの他の臓器にも存在します（図1A）。 定量的リアルタイム PCR 分析により、脳から単離された初代内皮細胞 (図 1B、C)、VAT (図 1D、E)、およびEnd.LepR-KO マウスの肺 (図 1F、G)、および CD31 陽性内皮細胞における低い LepR 免疫シグナルが、免疫蛍光顕微鏡法を使用して確認されました (図 1H)。

内皮細胞におけるLepRの誘導可能な遺伝子欠失を有するマウスの作製。 (A) 脳、内臓脂肪組織 (VAT)、皮下脂肪組織 (SCAT)、小腸および肺組織生検におけるレプチン受容体 (ΔLepR) のタモキシフェン誘発、Cre リコンビナーゼ媒介遺伝子切除。 バンドを示す関心領域が切り取られたゲルの全長画像は、補足情報ファイルに示されています。 脳から単離された内皮細胞における LepR、長い (B、D、F) および短い (C、E、G) アイソフォーム、mRNA レベルの定量的リアルタイム PCR 分析 (B、C; 1 グループあたり n = 5 ～ 7 匹のマウス) 、End.LepR-WT および End.LepR-KO マウスの VAT (D、E; n = 1 グループあたり 6 匹のマウス) または肺 (F、G; n = 1 グループあたり 6 ～ 8 匹のマウス)。 データは、正規分布の存在に応じて、Student の t 検定 (C – G) または Mann – Whitney 検定 (B) を使用して分析されました。 *p < 0.05、**p < 0.01、および ****p < 0.001。 (H) End.LepR-WT および End.LepR-KO マウスの脳、VAT、および肺における CD31 免疫陽性内皮細胞 (緑色) 上の LepR 発現 (マゼンタ) の代表的な蛍光顕微鏡画像。 細胞核は DAPI (青) を使用して視覚化されました。 サイズバーは 20 μm を表します。

雄および雌のEnd.LepR-WTおよびEnd.LepR-KOマウスにおける食餌誘発性肥満に対する内皮レプチン受容体の役割を調べるための実験ワークフローを図2Aに示します。 SD を与えられたマウスでは、End.LepR-WT マウスと End.LepR-KO マウスの間で平均体重に大きな差はありませんでした (雄: 28.4 ± 0.4 対 28.1 ± 0.3 g、P = 0.5623; 雌: 21.1 ± 0.3 対 21.6) ± 0.2 g、P = 0.1210)。 すべてのマウスはHFDに反応して肥満を発症しましたが、16週間にわたる平均体重変化と体重増加の割合は、両方の雄において、年齢を一致させたEnd.LepR-WT対照と比較して、End.LepR-KOマウスの方が有意に高かった(図1)。 ２Ｂ、Ｄ）および雌マウス（図２Ｃ、Ｅ）。 観察された違いは中程度でした。 16週間SDまたはHFDを与えられたEnd.LepR-WTおよびEnd.LepR-KO同腹子マウスの代表的な画像を図2Fに示します。

高脂肪食に反応して体重が変化します。 (A) 実験のワークフロー。 雄 (B) および雌 (C) End.LepR-WT および End.LepR-KO マウスの開始時および高脂肪食 (HFD) を 4、8、12、および 16 週間給餌した後の体重進行曲線。 グループごとに検査したマウスの数をグラフに示します。 *p < 0.05 および **p < 0.01、二元配置分散分析 (Sidak の多重比較検定) を使用して決定。 雄 (D) および雌 (E) End.LepR-WT マウスおよび End.LepR-KO マウスにおける、HFD の 16 週間後の体重増加。雄 (D) および雌 (E) の初期体重に対するパーセンテージ (100% に設定) として表されます。 **p < 0.01、スチューデントの t 検定を使用して決定。 (F) 標準的な実験室食または高脂肪食を16週間与えた雄および雌のEnd.LepR-WTおよびEnd.LepR-KOマウスの代表的な写真。

HFDを16週間与えた後、マウスを屠殺しました。 この時点で、内臓脂肪組織 (VAT) 重量は雌の End.LepR-KO マウスでのみ有意差があったのに対し、雄では雌に比べて高く、End.LepR-WT と End.LepR- の間で有意差はありませんでした。 KO マウス (図 3A)。 これらの発見と一致して、末梢脂肪組織量の指標であるレプチンの総循環レベル 18 は、End.LepR-WT 対照と比較して雌の End.LepR-KO マウスでのみ有意に増加し、雄では差がありませんでした（図 3B）。 ）。 レプチンの主な結合タンパク質であり阻害剤である可溶性レプチン受容体（sLepR）の血漿レベルは、雄と雌の End.LepR-WT マウスと End.LepR-KO マウスの間で差がありませんでした（図示せず）。 VAT による H&E 染色断面の組織学的分析により、雌 End.LepR-KO マウスでは個々の脂肪細胞の平均面積が増加し、雄ではより高いが同様の平均脂肪細胞面積が確認されました (図 3C、D)。 内皮 LepR の非存在下では、より顕著な脂肪細胞肥大が分子レベルで確認されました。雌マウスの全 VAT ホモジネートの QPCR 分析により、脂肪細胞のペルオキシソーム増殖因子である脂肪酸結合タンパク質 4 (Fabp4) (図 3E) の mRNA レベルが示されました。脂質輸送または脂質生成に関与する活性化受容体ガンマ (Pparg) (図 3F) およびカテニン ベータ-1 (Ctnnb1) (図 3G) も有意に増加しましたが、脂肪分解を制御するペリリピン (Plin) の mRNA レベルは増加しました。 、End.LepR-KOマウスでは有意に減少しました（図3H）。 一方、レプチンの mRNA レベルには有意な差はありませんでした (図 3I)。 注目すべきことに、Fabp4 は脂肪組織内の脂肪酸輸送に関与する微小血管内皮細胞にも発現しています 22。 これに関して、Fabp4 mRNA レベルは、End.LepR-WT マウスと End.LepR-KO マウスの VAT から単離された内皮細胞間で有意な差はありませんでした (P = 0.616; n = 5 生物学的複製/グループ; 示さず)。 脂肪細胞分化の亢進に伴い、End.LepR-KO マウスでは前脂肪細胞因子 1 (Pref1、Dlk1 としても知られる) の mRNA レベルが大幅に減少しました (図 3J)。一方、血小板由来成長因子アルファ (Pdgfra) の mRNA レベルは減少しました。 ;図3K）、線維芽細胞および脂肪細胞前駆細胞のマーカー23、またはサイクリンD1（Ccnd1;図3L）または増殖細胞核抗原（Pcna;図示せず）などの細胞増殖のマーカーは、有意な差はありませんでした。

内臓脂肪蓄積、高レプチン血症、および脂肪生成遺伝子の発現。 16 週間高脂肪食 (HFD) を与えた雄および雌の End.LepR-WT および End.LepR-KO マウスの内臓脂肪組織 (VAT) 重量 (A) および血清レプチン レベル (B)。 データは、クラスカル・ウォリス検定、ダンの多重比較検定を使用して比較されました。 *p < 0.05、***p < 0.001、****p < 0.0001。 ns、有意ではありません。 二元配置分散分析により、有意な性別による欠失の相互作用が示されました (A では p = 0.0152、B では p = 0.0024)。 (C) End.LepR-WT および End.LepR-KO マウスの H&E 染色パラフィン包埋 VAT 組織切片の代表的な顕微鏡画像。 スケール バーは 200 μm を表します。 平均脂肪細胞面積の形態計測解析の結果を(D)に示します。 データは、Sidak の多重比較検定である一元配置分散分析を使用して比較されました。 **p < 0.01 および ****p < 0.0001。 二元配置分散分析により、有意な性別による欠失の相互作用が示されました (p = 0.0117)。 脂肪酸結合タンパク質-4 (Fabp4; E)、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ (Pparg; F)、カテニン ベータ-1 (Ctnnb1; G)、ペリリピン-1 (Plin; H)、レプチン (雌 End.LepR-KO マウス (n = 12) の VAT における Lep; I)、前脂肪細胞因子 1 (Pref-1; J)、血小板由来増殖因子 α (Pdgfra; K) およびサイクリン D1 (Ccnd1; L) 16週間のHFD後。 データは、参照遺伝子 (RPLO) の発現に対して正規化した後、ΔΔCt 法を使用して、雌 End.LepR-WT 同腹子マウス (n = 9) と比較した遺伝子発現として報告されます。 データは、Student の t 検定 (F、H) または Mann-Whitney 検定 (E、G) を使用して分析されました。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。

肥満に伴う VAT 炎症の程度の違いに関して、フローサイトメトリーでは、CD45+ Lin- CD11b+ Ly6Chigh CXCR1+ MHCII- 炎症性単球 (図 4A、B) および CD45+ Lin- CD11b- CD11c+ MHCII+ 単球 (図 4C、図 4C) の数が有意に多いことが明らかになりました。 D) End.LepR-WT コントロールと比較した End.LepR-KO マウスの VAT。 免疫組織化学により、より多数の Mac2 陽性マクロファージ (図 4E、F)、王冠様構造として組織化されたもの (CLS; 図 4G)、または多核巨細胞に融合したもの (MGS; 図 4H) が確認されました 24。 VAT 中の CD31 免疫陽性内皮細胞の総数は、End.LepR-WT マウスと End.LepR-KO マウスの間で差はありませんでした (補足図 1A、B)。 平均脂肪細胞面積が大きくなった結果、顕微鏡視野あたりの脂肪細胞数が大幅に減少しました（女性では P = 0.0077 対 End.LepR-WT; 男性では P = 0.8359 対 End.LepR-WT; データは示されていません） ）、雌の End.LepR-KO マウスでは、脂肪細胞あたりの CD31 免疫陽性細胞の相対数が有意に増加しました（補足図 1C）。 内皮細胞活性化マーカーのメッセンジャー RNA レベルは、End.LepR-WT マウスと End.LepR-KO マウスの内皮細胞間で有意な差はありませんでした（補足図 2A-C）。

内臓脂肪組織の炎症。 フローサイトメトリーを使用して、高脂肪食（HFD）を16週間与えたEnd.LepR-WTおよびEnd.LepR-KOマウスの内臓脂肪組織（VAT）ホモジネート中の免疫細胞サブセットを分析しました。 MHC-II および Ly6C の分析後の代表的なドット プロットを (A) に、CD11c および MHC11 の分析を (C) に、CD45+ Lin- CD11b+ Ly6Chigh CXCR1+ MHCII- 細胞の定量分析の結果を (B) および CD45+ に示します。 (D) ではそれぞれ Lin- CD11b- CD11c+ MHCII-。 データは VAT における総生細胞の % として表され、一元配置分散分析 (Sidak の多重比較検定) を使用して比較されました。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.005。 (E) 16 週間 HFD を与えた End.LepR-WT および End.LepR-KO マウスの VAT におけるマクロファージの免疫組織化学分析後の代表的な画像。 スケールバーは 100 μm を表します。 Mac2免疫陽性領域の定量解析の結果を(F)に、脂肪細胞100個あたりの冠状構造(CLS)または有核巨細胞の数を(G)と(H)にそれぞれ示します。 データはスチューデントの t 検定を使用して分析されました。 *p < 0.05 および **p < 0.01。

肥満および慢性（脂肪組織）炎症は、インスリン抵抗性や糖尿病などの代謝変化によって複雑になることがよくあります。 これに関して、6時間絶食させたEnd.LepR-WTおよびEnd.LepR-KOマウスにおける血清グルコースおよびインスリンレベルの分析では、血清グルコース(補足図3A)または血清インスリン(補足図3A)の差異は明らかにされなかった。 3B）レベル。 耐糖能試験では、16 週間 SD (補足図 3C) または HFD (補足図 3D) を与えたマウスに有意差は確認されませんでしたが、後者ではブドウ糖除去が速くなる傾向が観察されました。 また、平均肝臓重量は End.LepR-WT マウスと End.LepR-KO マウスの間で差はなく (補足図 4A)、オイルレッド O で染色した後の凍結包埋断面の組織学的分析により、同様の量の貯蔵中性脂質が明らかになりました。 (補足図4B、C)。

毎日の食物消費、エネルギー消費、または身体活動の違いが End.LepR-KO マウスのより顕著な肥満に寄与しているかどうかを調べるために、間接熱量測定を使用しました。 個々の雄​​および雌の同腹子マウスを SD で 1 週間観察し、その後 HFD で 1 週間観察しました (n = 3 回の独立した実験; n = 12 の生物学的反復)。 End.LepR-KO マウスは、より高い総食物消費量 (図 5A ～ D) と総エネルギーバランス (図 5E、F) を示しました。 一方、歩行者の歩行（図示せず）、歩行活動（補足図5A、B）またはケージ移動の総距離（補足図5C、D）として測定された毎日の身体活動には、有意な差はありませんでした。 酸素消費量 (VO2; 補足図 6A、B)、二酸化炭素生成 (VCO2; 補足図 6C、D)、および呼吸交換率 (補足図 6E、F) も同様であり、エネルギーの酸化が変化していないことを示しています。 End.LepR-KO マウスの基質。

総食物消費量、エネルギーバランス、外因性レプチンの脳への輸送。 12 時間の昼夜繰り返しサイクルで代謝ケージ内で記録された、雄 (A) および雌 (C) End.LepR-WT および End.LepR-KO マウス (各グループ n = 3) の総食物摂取時間プロット。 マウスには標準実験食（SD）を7日間与え、その後さらに7日間高脂肪食（HFD）に切り替えました。 雄 (B) および雌 (D) End.LepR-WT および End.LepR-KO マウスの 14 日間に消費された総食物の概要。 雄 (E) および雌 (F) End.LepR-WT および End.LepR-KO マウスにおける SD から HFD への食事切り替え前後の総エネルギー バランスの時間プロット。 (G) End.LepR-WT および End.LepR-KO マウスの凍結包埋脳切片の代表的な蛍光顕微鏡画像。ローダミン標識レプチン (赤色) を腹腔内注射し、内皮細胞を視覚化するために FITC 標識レクチンを ic 注射した (緑色）LepR の免疫染色（マゼンタ）。 DAPI 陽性細胞核は青色です。 (H) 40 × 顕微鏡視野の総面積あたりのローダミン レプチン陽性面積の定量分析の概要。 **p = 0.01、スチューデントの t 検定を使用して決定。

満腹ホルモンであるレプチンの循環レベルを感知するには、血液脳関門の細胞上に発現するレプチン受容体へのレプチンの結合と、それに続くトランスサイトーシスが必要です25、26、27。 蛍光顕微鏡分析により、End.LepR-WT マウスの正中隆起の内側および脳全体の内皮細胞への外因性のローダミン標識組換えレプチンの結合が実証されましたが、End.LepR-WT マウスの脳では外因的に投与されたレプチンの低いシグナルが検出されました。 KOマウス。 代表的な例を図 5G に、定量分析の結果を図 5H に示します。 これらの所見は、内皮LepR欠損マウスで観察されるより顕著な肥満と食物摂取量の増加は、血液脳関門を通過する満腹因子のトランスサイトーシスの障害の結果として起こっていることを示唆した。 VAT 組織切片の分析でも、End.LepR-KO マウスにおけるローダミン標識レプチンが大幅に減少しているという同様の所見が明らかになりました (補足図 7A、B)。

レプチントランスサイトーシスの制御を超えて、体重の制御における内皮細胞に対するLepRの役割をさらに研究するために、End.LepR-KOおよびEnd.LepR-WTマウスの脳およびVATから初代内皮細胞を単離し、その生体エネルギープロファイルを調べた。リアルタイムで調べられます。 ただし、細胞外酸性化速度 (ECAR; 解糖の指標) と酸素消費速度 (OCR; ミトコンドリア呼吸の指標) は、End.LepR-WT マウスと -KO マウスの脳から単離された内皮細胞間で有意な差はありませんでした。 SDを与えられたマウスでもHFDを与えられたマウスでも影響はなかった(図6A、B;生データは補足図8A、Bに示されている)。 ECARおよびOCRも、End.LepR-WT対照と比較して、End.LepR-KOマウスのVATから単離された内皮細胞において類似していた(図6C、D;生データは補足図8C、Dに示されている)。

脳の炎症と初代脳および VAT 内皮細胞のエネルギー プロファイル。 女性 End.LepR-WT (n = 4-5) および End の脳 (A、B) または内臓脂肪組織 (VAT; C、D) から単離された生きた初代内皮細胞における解糖およびミトコンドリア呼吸の分析後の所見の概要.LepR-KO (n = 7) マウスに標準実験食 (SD) または高脂肪食 (HFD) を 16 週間与えました。 分析は、Seahorse XF96e 細胞外フラックス アナライザーを使用して実行されました。 結果は細胞数に対して正規化し、End.LepR-WT マウスに対する変化倍数として表します。 データは、一元配置分散分析 (Sidak の多重比較検定) を使用して分析されました。 Ns、重要ではありません。 CD206 に対する抗体で染色した、16 週間高脂肪食を与えた End.LepR-WT (n = 7-8) および End.LepR-KO (n = 7) マウスの凍結包埋脳切片の代表的な免疫蛍光画像(緑) と CD31 (赤) (E)、または Mac2 (緑) と VEGF (赤) に対する (H)。 サイズバーは 20 μm を表します。 CD206 (F)、CD31 (G)、Mac2 (I)、または VEGF (J) に対して免疫陽性の領域を定量化した後の結果。40 × 顕微鏡視野の合計領域ごとに表されます。 データはスチューデントの t 検定を使用して分析されました。 *p < 0.05 および **p < 0.01。

以前の研究では、肥満における内皮細胞の代謝の維持における炎症細胞由来のサイトカインの役割が示唆されています28。 脳切片の免疫蛍光顕微鏡分析では、VAT と同様に、HFD 摂取が多数の炎症細胞と関連していることが示されました。 具体的には、CD31 免疫陽性内皮細胞の近傍にある CD206 免疫陽性細胞の数 (図 6E ～ G) および VEGF を発現する Mac2 免疫陽性マクロファージの数 (図 6H ～ J) は、End.LepR の方が高かった。 -KO マウスと End.LepR-WT マウスの比較。

脳および VAT での所見とは対照的に、解糖系およびミトコンドリアの ATP 生成率は、End.LepR-KO マウスの肺から単離された内皮細胞では、食事とは無関係に有意に増加しました (図 7A-D)。 しかしながら、グルコーストランスポーター（すなわち、Glut1；図７Ｅ）または解糖酵素（すなわち、Hk2、Pfkb3；図示せず）、ならびにミトコンドリア機能の調節因子であるミトコンドリアマーカー（すなわち、Idh；図７Ｆ）のmRNAレベルのqPCR分析は、 （すなわち、Ｓｉｒｔ３；図７Ｇ）またはミトコンドリア生合成の活性化因子（すなわち、Ｐｃｇ１α；図示せず）は、Ｅｎｄ．ＬｅｐＲ−ＷＴおよび−ＫＯマウスの肺から単離された初代ＥＣ間で有意な差はなく、代謝活性化の代替経路を示唆する。

初代肺内皮細胞におけるエネルギー代謝と解糖酵素またはミトコンドリアマーカーの発現。 女性の End.LepR-WT (n = 7) および End.LepR-KO (n = 7) から分離された生きた初代内皮細胞における細胞外酸性化速度 (ECAR; A) と酸素消費速度 (OCR; B) の代表例）マウスには標準食を与えた。 データは、Sidak の多重比較テストである二元配置 ANOVA を使用して分析されました。 *p < 0.05 および **p < 0.01 対同じ時点の End.LepR-WT マウス。 有意でない差異は示されていません。 標準食 (SD) または高脂肪食を与えた End.LepR-WT および End.LepR-KO マウスにおける解糖またはミトコンドリア呼吸を決定するために ECAR (C) または OCR (D) を測定した n = 4 の独立した実験からの結果の概要ダイエット（HFD）。 結果は細胞数に対して正規化し、End.LepR-WT マウスに対する変化倍数として表します。 データは、Sidak の多重比較テストである一元配置分散分析を使用して比較されました。 *p < 0.05、**p < 0.01、****p < 0.0001 対 End.LepR-WT マウス。 雌の End.LepR-WT および End.LepR-KO マウスの初代肺内皮細胞における Glut1 (E)、Idh (F)、および Sirt3 (G) の定量的リアルタイム PCR 分析 (グループあたり n = 10)。 データはスチューデントの t 検定を使用して比較されました。 Ns は重要ではありません。

アディポカイン レプチンは、主に神経細胞上の LepR に作用することにより、体重とエネルギー消費を制御します 29。 レプチン受容体は、体中のさまざまな種類の細胞で発現されます 30。 今回我々は、内皮細胞上のレプチン受容体が食物摂取と体重の調節に関与していることを示し、血液脳関門を通過するレプチンの輸送低下が潜在的なメカニズムの1つであることを特定する。 体重が増加したにもかかわらず循環レプチンレベルが上昇したことにより、内皮レプチン受容体を欠くマウスにレプチン耐性が存在することが確認された。 VAT 炎症や脂肪生成遺伝子発現など、体重増加によるその他の間接的な影響もより顕著でしたが、血清グルコースやインスリン、全身の代謝や身体活動レベルは変化しませんでした。 観察された変化は中程度であり、肥満誘発性の食事を与えたマウスでのみ測定可能であり、内皮LepRが肥満の発症に因果的に関与しているのではなく、むしろ修飾する役割を果たしていることが示唆された。

体重とエネルギー恒常性の調節は複雑なプロセスであり、中枢神経系および脂肪組織、骨格筋、肝臓などの末梢器官のレベルで制御されます31。 食物摂取とエネルギー消費の制御におけるレプチンとその受容体の役割は、レプチン欠損ob/obマウス、またはすべての細胞に変異した非機能的LepRを発現するdb/dbマウスにおける重度の肥満の発見によって数年前に示唆された。体全体に。 体重恒常性における神経細胞上のレプチン受容体の主要な役割を強調すること、すべてのニューロン（シナプシン I-Cre を使用）32 またはアグーチ関連ペプチドを発現する神経細胞集団などの定義された神経細胞集団における LepR の選択的遺伝的欠失 33 であるが、肝細胞ではそうではない 32 、重度の肥満と糖尿病を引き起こしましたが、db/db マウスの表現型はレプチン受容体のニューロンの再発現によって回復する可能性があります 34,35。 神経細胞上の LepR の存在は「必要かつ十分」であることが示されています 36 が、体重の制御における非神経細胞上のレプチン受容体の役割も報告されています 37。 マウスにおけるこれまでの遺伝的および薬理学的アブレーション研究では、アストロサイト 38,39 または希突起膠細胞前駆体/グリア細胞 40 におけるレプチンシグナル伝達が、正常なエネルギー恒常性の維持に役割を果たしていることが特定されました。 血管周囲細胞 41,42 や内皮細胞 5,43 など、脳内の他の LepR 発現細胞も、レプチン取り込みのメディエーターとして作用することにより、中枢神経系の体重制御に関与していると考えられています。 Creドライバーとして脳毛細血管内皮細胞に発現する膜貫通受容体であるSlco1c1（溶質キャリア有機アニオントランスポーターファミリーメンバー1C1）を用いたLepRの遺伝子欠失44により、視床下部への放射性標識レプチンの輸送が約40％減少することが明らかになった36。 外因性レプチンに対する反応は観察されなかったが、我々の発見と同様に、3ヶ月にわたってモニターされた体重増加はHFD36を与えられたマウスでのみ影響を受けた。 短いLepRアイソフォームが全体的に欠失しているHFD給餌マウスでは、血漿レプチンレベルと体重のわずかな増加も観察されました45。 私たちの研究では両方の LepR アイソフォームの内皮発現が減少しましたが、これらの発見は、短い LepR アイソフォーム、つまり末梢細胞で広く発現されるアイソフォーム 46 の欠如で十分であった可能性があることを示唆しています 47。

レプチン受容体は全身の内皮細胞に発現します48。 それらの役割を調べるために、以前の研究では、Tie2 発現細胞 (内皮細胞だけでなく造血細胞も含む) で膜結合型切断型 LepR を構成的に発現するマウスを使用しました 6,8。 これらのいわゆるELKOマウスは肥満から部分的に保護されており、血中レプチンレベルが上昇しているにもかかわらず、HFDに応答して代謝表現型が適度に改善されました8。 これらの以前の報告とは対照的に、本研究では、最初のエクソンに loxP 配列が隣接し、Cre 組換え後に LepR を完全に欠失させたマウスが検討され 32、Tie2 発現内皮を選択的に標的とするために成体マウスで Cre リコンビナーゼ活性が誘導されました。造血細胞ではありません49。 したがって、HFD も生後 6 週目ではなく、より遅く開始され 8、成長中に通常起こる体重増加を回避しました。

ヒトの肥満は、エネルギー摂取と消費の間の不均衡の結果、おそらく循環レプチンレベルの上昇によるレプチンシグナル伝達の障害の結果として発生します。 間接熱量測定により、内皮LepR欠失および血液脳関門を通過するレプチンの輸送障害に伴う「認識された」レプチンレベルの低下と一致して、HFDを与えたEnd.LepR-KOマウスの食物摂取量と総エネルギーバランスに有意な差が示された。肥満におけるレプチン耐性の発現の根底にあるメカニズム50。 注目すべきことに、Tie2発現細胞またはアストロサイトで切断型LepRを発現するマウスでは、血液脳関門を通過するレプチン輸送に変化が見られなかった7。 いくつかの研究では、肥満マウスでは血液脳関門を通過するレプチン輸送が無傷であることや、レプチンが心室周囲器官を介した直接輸送を介して脳に到達する可能性があることを示唆している52。 第三脳室の床を裏打ちする特殊なグリア細胞であるタニサイトは、末梢投与されたレプチンの脳への輸送を媒介することが示唆されており 53、タニサイト特異的な LepR の欠失は高レプチン血症と体重増加の増加を引き起こす 54 が、他の研究室ではレプチンが発見されているタニーサイトに依存しない視床下部STAT3シグナル伝達の変化を誘導する55。 注目すべきことに、血液脳関門を通過するレプチンの輸送は、LepR だけでなく、EGFR などの他の受容体との相互作用や、メガリン/LRP などの他の受容体へのレプチンの結合にも依存します 256,57。 これらの受容体に結合するレプチンの親和性は、LepR58 よりもはるかに低いことが示されていますが、これらのメカニズムは高レプチン血症の状態に関連する可能性があります。

End.LepR-KO マウスにおける（機能的）レプチン耐性の発現と一致して、肥満はレプチンレベルの上昇と関連していました。 End.LepR-WT マウスと End.LepR-KO マウスの VAT ではレプチン mRNA 発現レベルに違いはありませんでしたが、ELKO マウスでの所見を裏付ける6、レプチンを産生する脂肪細胞の数の増加がこの観察に寄与した可能性があります。 脂肪組織量の増加の結果であることに加えて、レプチンレベルの上昇は、脳または他の臓器への内皮LepR取り込みの減少の結果として発生した可能性があります6。 主にメスのマウスにおける内臓脂肪蓄積と高レプチン血症の増加という我々の観察に関して、我々はHFDが人生の比較的遅い時期に開始されたという事実と、すでに体重の重い雄のマウスではこれらのパラメーターの違いが検出できなかった可能性があるという事実に起因すると考えています。 これまでの in situ ハイブリダイゼーション研究では、雄ラットと雌ラットの間で弓状核、腹内側核、視床および梨状皮質における LepR 発現に差は見られなかったが、LepR 遺伝子発現はエストラジオール投与に反応して減少し、卵巣切除後に増加した 59。

体重制御のニューロン中枢へのレプチン輸送の制御を超えた、内皮細胞におけるレプチン受容体の役割に関して、我々は、マウスにおける内皮レプチン受容体の誘導的遺伝的欠失、またはヒト内皮細胞におけるレプチン受容体のsiRNA媒介下方制御を示した。 mTOR 阻害や細胞飢餓と同様に、心臓内皮細胞のオートファジーが引き起こされます 17。 本研究では、内皮細胞の代謝変化は、肺など体重の制御に関与することが知られていない末梢臓器から単離された細胞でのみ観察されたが、脳およびVATから単離された細胞ではエネルギー基質の処理に変化はなかった。 最近、肥満マウスの脳のVEGF産生血管周囲マクロファージで示されているように、炎症細胞で産生される因子は内皮の代謝機能を保存し、保護機構として機能している可能性がある28。 最近、単一細胞配列解析により、肥満に対する感受性における臓器特異的な違いが示され 60、これも役割を果たしている可能性がありますが、本研究では調べることができませんでした。 また、内皮細胞上の LepR の欠如は、交感神経の脂肪神経支配 61 またはアンジオクリンメディエーター 62 を変化させることにより、脂肪代謝に影響を与えた可能性があります。

まとめると、我々の発見は、脳へのレプチンの輸送と食物摂取の神経制御の媒介における内皮LepRの役割を裏付けるが、全身のエネルギー代謝ではなく、内皮細胞におけるエネルギー産生が臓器特異的な方法で変化したことを裏付けるものである。 。

内皮細胞におけるタモキシフェン誘導性の Tie2.Cre-ERT2 媒介 LepR 欠失マウスの作製は、以前に記載されています 12,17。 Cre リコンビナーゼ活性化のために、マウス (6 週齢) にクエン酸タモキシフェンを含む齧歯類用飼料 (Envigo; TD.130860) を 6 週間与えました 49。 脳、肺、小腸、皮下脂肪組織 (SCAT)、および内臓脂肪組織 (VAT) からのゲノム DNA を、0.2 mg/mL プロテイナーゼ K (Peqlab) を含むダイレクト PCR 溶解試薬 (Peqlab) を使用して単離しました。 マウスの遺伝子型は、以下のプライマーを使用して決定されました: Tie2.Cre (Tie2Cre1: 5'-CGA GTG ATG AGG TTC GCA AG-3'; Tie2Cre2: 5'-TGA GTG AAC GAA CCT GGT CG-3'); LepR (LepRflox1: 5'-GTC ACC TAG GTT AAT GTA TTC-3'; LepRflox2: 5'-TCT AGC CCT CCA GCA CTG GAC-3'。タモキシフェンによる LepR 遺伝子の欠失は、以下のプライマーを使用して確認されました: LepRflox1: 5 '-GTC ACC TAG GTT AAT GTA TTC-3' および LepR デルタ/Δ: 5'-GCA ATT CAT ATC AAA ACG CC-3')。 タモキシフェンを含むげっ歯類の餌を与えられた、性別を一致させた同腹子 Tie2.ERT2-WT LepRflox/flox マウスを、研究全体を通じて対照として使用しました。

タモキシフェン食後、同腹子の雄と雌のマウスに、マウス用の標準実験室食（SD）（V1124-300; ssniff®）を 2 週間給餌し、その後、肥満を誘発するために 45 kcal-% HFD（D12451; Research Diets）に自由に切り替えました。 。 体重を 4 週間前と 4 週間ごとに合計 16 週間測定しました。 動物を含むすべての実験手順は、地元の動物倫理委員会（トランスレーショナル動物研究センター、マインツ大学医療センター）およびラインラント・プファルツ州立法府（動物許可 G16-1-081）によって事前に承認されており、国家管理ガイドラインに準拠していました。および実験動物の使用。 この研究はARRIVEガイドラインに従って報告されています。

エネルギー消費、身体活動、O2 消費と CO2 生成、および食物と水の摂取量を継続的かつ同時に測定するために、SD のマウスのサブセットを代謝ケージ (Promethion High-Definition Multiplexed Respirometry Cage; Sable Systems™) に移しました。 各ケージには、アスペンチップ、餌ホッパー、およびケージの蓋に組み込まれた餌/水摂取監視システムに接続された水ボトルが並べられていました。 身体活動は、BXYZ ビームブレイク活動監視システムを使用してリアルタイムで監視されました。 標準的な動物飼育条件での 5 日間の平衡期間の後、代謝パラメータを SD で 7 日間記録し、その後さらに 7 日間 45% HFD で記録しました。 温度を 22 °C に一定に保ち、照明をそれぞれ 6:00 と 18:00 に点灯および消灯するように設定して、12 時間の明暗サイクルを維持し、活動パターンと概日周期を相関させました。 各実験 (n = 3 実験反復) ごとに、End.LepR-WT および End.LepR-KO (実験あたり n = 4 マウス) を研究しました。 CalR Web ツールを使用して、プロットと統計分析を作成するために間接熱量測定の生データを分析しました。 代謝パラメーターは、平衡段階の開始時に記録されたマウスのそれぞれの個別の体重に対して正規化されました 63。

同腹子マウスのサブセットでは、SD または HFD を 14 週間給餌した後に耐糖能試験を実施しました。 マウスの代謝研究で推奨されているように 6 時間餌を除去した後 (自由に水を飲みながら)、マウスに 20% グルコース溶液を 2 g/kg 体重 (腹腔内グルコース注射量) の用量で腹腔内注射しました。 (μL) = 10 × 体重 (g))、および (尾静脈) 血糖値を、CONTOUR® NEXT 血糖モニタリング システム (Ascensia Diabetes Care) を使用して、グルコース投与前と投与後 15、30、60、120 分に測定しました。所蔵）。

16 週間の HFD 後、マウスを深く麻酔し (0.9% 塩化ナトリウム溶液中の塩酸ケタミン [75 mg/kg 体重] と塩酸キシラジン [15 mg/kg 体重)] の混合物を使用)、全血を採取しました。上記のように、心臓穿刺によって空腹時血糖値を測定します。 残りを室温で30分間凝固させた後、血清を調製した。 マウスは深い麻酔下で頚椎脱臼により屠殺された。 彼らの脳、内臓性腺周囲脂肪組織 (VAT) および肝臓が摘出され、重量が測定され、その後の分子分析または組織学的分析、あるいは内皮細胞の単離に備えられました。 一部のマウスでは、ローダミン標識レプチン (FR-003-13、Phoenix Pharmaceuticals; 5 mg/kg 体重) を腹腔内 (ip) 注射による組織採取の 45 分前に注射しました。 次に、Griffonia Simplicifolia 由来のフルオレセイン標識レクチン I (FL-1201、Vector Laboratories) を組織採取の 15 分前に心臓内 (ic) 注射して、機能的な血管およびミクログリア細胞を in vivo で標識しました。 組織は、凍結保存および蛍光顕微鏡分析のために準備されました。

血清は 3000 rpm で 10 分間遠心分離して調製し、分析まで -80 °C で保存しました。 空腹時血清グルコースは、比色アッセイ(BioAssay Systems)を使用して測定した。 市販の酵素免疫測定法を使用して、マウスレプチン (R&D Systems Inc; 検出範囲: 1.58 ～ 5.56 pg/mL)、可溶性レプチン受容体 (sLepR; 抗体オンライン、ABIN773812) またはインスリン (Crystal Chem、#90060;検出範囲: 0.1 ～ 12.8 ng/mL)、メーカーの指示に従ってください。

パラフィン包埋組織切片および組織学を調製するために、VAT の一部を 4% 亜鉛ホルマリン (Sigma) で一晩固定し、続いて 70% エタノール (Carl Roth) でインキュベートし、パラフィン (Surgipath® Paraplast; Leica Biosystems) に包埋しました。 。 厚さ 5 μm の連続断面を脱パラフィンし、ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) で染色して、単一の脂肪細胞の面積を測定しました。 免疫組織化学では、脱パラフィン切片を一連の段階的アルコールで洗浄し、続いて熱誘発抗原賦活化（0.01 M クエン酸緩衝液、pH 6.0 で 6 分間）を行った後、10% 正常血清（abcam）でブロックしました。 切片を、Mac2に対する一次ラットモノクローナル抗体(CL8942AP; Cedarlane Laboratories; 抗体希釈剤(Dako)で1:400に希釈)とともに4℃で一晩インキュベートした。 検出のために、切片を二次抗体 (希釈: 1:1000; Molecular Probes) とインキュベートし、続いてアビジン-ビオチン複合体 (Vector Laboratories) およびアミノエチルカルバゾール基質 (abcam) と発色するまでインキュベートしました。 切片をギルヘマトキシリン (Sigma) で簡単に対比染色し、ImmuMount (ThermoScientific) にマウントし、倍率 20 倍で写真を撮影しました (Olympus BX51 顕微鏡)。 Ｍａｃ２免疫シグナルは、Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ（バージョン７．０）ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）を使用して総面積のパーセンテージとして定量化した。 凍結保存および凍結切片の調製のために、組織を直ちに Tissue-Tek OCT コンパウンド (Sakura via Science Services GmbH) に包埋しました。 肝臓の脂質蓄積を分析するために、厚さ 8 マイクロメートルの凍結切片を 4% ホルムアルデヒドで 15 分間固定し、1 × PBS で 3 回洗浄した後、0.5% オイルレッド O (Sigma) で室温で 1 時間染色しました。 組織を洗浄し、ヘマトキシリンで対比染色し、倒立光学顕微鏡（Motic AE31、Motic）で倍率20倍で写真撮影した。

単一の脂肪細胞の面積は、前述のように決定されました65。 簡単に説明すると、VAT の厚さ 5 μm の断面を H&E で染色し、オリンパス BX51 顕微鏡を使用して 10 倍の倍率で写真を撮影しました。 各断面から 5 つの代表的な画像を取得し、画像あたり少なくとも 10 個の脂肪細胞をランダムに選択し、画像解析ソフトウェア (Image-Pro Plus、バージョン 7.0) を使用して測定しました。 結果はマウスごとに平均されました。 肝臓切片上のオイルレッド O 陽性領域を各動物あたり 5 枚の画像で決定し、結果をマウスあたり平均しました。

免疫蛍光分析では、以下に説明するように、厚さ 8 μm の凍結切片を処理しました。 切片を室温で5分間解凍し、1×PBS（pH 7.5）で洗浄（2×5分）した後、氷冷アセトン（PanReac AppliChem）中で-20℃で10分間固定しました。 切片を洗浄し、1 × PBS (3 × 5 分) で再水和し、0.05% Triton X-100 (PBS 溶液; Roth) 中で 37 °C で 10 分間透過処理しました。 一次抗体を抗体希釈液 (Dako) で希釈し、切片を 4 °C で一晩インキュベートしました。 次の一次抗体を使用しました：抗 Mac2 (CL8942AP; Cedarlane Laboratories)、抗 CD206 (ab64693; abcam)、抗 VEGF (ABS82、Millipore)、抗 LepR (AF498; R&D Systems)、および抗 CD31 ( sc18916; サンタクルーズバイオテクノロジー）。 切片を PBS で洗浄し、続いて 1 × PBS 中の二次抗体とともに暗所、室温で 2 時間インキュベートしました。 使用した次の二次抗体は次のとおりです: Alexa Fluor™ Plus 647 ロバ抗ヤギ (A32849; Life Technologies)、Alexa Fluor™ 488 ヤギ抗ラット (ab150157; abcam)、Alexa Fluor™ 555 ヤギ抗ラット (ab150154; abcam) 、Alexa Fluor™ Plus 488 ヤギ抗ウサギ (A32731、Life Technologies) および Alexa Fluor™ Plus 555 ヤギ抗ウサギ (A32732、Life Technologies)。 細胞核は、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI; Sigma) を使用して視覚化しました。 非特異的免疫染色を除外するために、切片を二次抗体のみとともにインキュベートしました。 画像は、40×対物レンズとBZ-X800画像ソフトウェアを備えた倒立蛍光顕微鏡（Keyence; BZ-X810）を使用して取得しました。 Image-Pro Plus ソフトウェアを使用して、動物あたり少なくとも 5 つの画像で免疫シグナルを定量化し、結果をマウスあたり平均しました。

初代マウス内皮細胞 (mPEC) を脳、肺、および VAT から単離しました。 データシートに記載されているプロトコールに従って、パパイン解離システム (ワーシントン) を使用して、脳および VAT からの初代内皮細胞を単離しました。 End.LepR-WT および End.LepR-KO マウスの肺からの初代マウス内皮細胞は、以前に記載されているように、マウス CD31 マイクロビーズ (Miltenyi Biotec) を用いた磁気セルソーティングを使用して単離されました 10。 細胞を０．１％ゼラチンコート細胞培養プレート上で培養し、コンフルエントになるまで内皮細胞増殖培地ＭＶ２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）中で維持した。 細胞は継代 0 と 2 の間で分析されました。

生きた内皮細胞における解糖とミトコンドリア呼吸による総 ATP 生成速度を研究するために、Seahorse XF96e 細胞外フラックス アナライザー (Agilent Technologies) を使用して Seahorse XFp リアルタイム ATP 速度アッセイを実行しました。 アッセイを行う 1 日前に、内皮細胞をゼラチンコート XF96 (V3) ポリスチレン細胞培養プレート (Agilent Technologies) にプレーティングし、MV2 培地 (PromoCell) で培養しました。 24 時間後、培地を、1 mM ピルビン酸、2 mM l-グルタミンおよび 25 mM グルコース (すべて Sigma-Aldrich) を補充した XF アッセイ培地 (1 mM HEPES を含む XF RPMI; Agilent Technologies; #103576-100) に交換しました。細胞は、非 CO2 インキュベーターとして使用される SpectraMax i3 (VWR; INCU-Line) 内で 37 °C で 45 分間インキュベートされ、細胞の均一な播種を記録するために伝導明視野イメージングが行われます。 センサーカートリッジのキャリブレーションと初期化の後、各化合物の添加前に 3 つのベースライン測定値が記録され、ポート A から ATP シンターゼ阻害剤オリゴマイシン (1.5 μM)、複合体 1 阻害剤ロテノン (アッセイの完了後、細胞を BioTracker NIR694 Nuclear Dye (Sigma、#SCT118) で染色し、SpectraMax MiniMax 300 Imaging を使用して正規化のためにカウントしました。サイトメーター (分子デバイス)。 細胞核は、SoftMaxPro 6.5.1 ソフトウェアを使用して、赤のチャネルでオブジェクト識別のサイズとしきい値を設定することにより自動的に識別されました。 データ分析は、Wave 2.6.3.5 ソフトウェア (Agilent Technologies) を使用して実行されました。

前述のように、TRI Reagent® (Ambion) 溶液を使用して、初代マウス内皮細胞から全 RNA を単離しました10。 脂肪組織から全 RNA を単離するために、新たに採取したマウス VAT を小片に切断し、0.5 mL の TRI 試薬を含む 2 mL RNase/DNase フリーのチューブに移し、氷上で機械的にホモジナイズしました (Miccra ホモジナイザー)。 ホモジネートを12,000×gで15分間遠心分離して、水相表面の脂質画分を除去した。 次に、水相を新しい 1.5 mL チューブに移し、続いて 100 μL クロロホルムを使用した相分離の RNA 単離ステップを行い、激しく混合し、12,000 xg、4 °C で 15 分間遠心分離しました。 水層を 500 μL のイソプロピルアルコールを含む新しいチューブに移し、混合して RNA を沈殿させました。 氷上で20分間インキュベートした後、沈殿したRNAを12,000×g、4℃で10分間遠心沈降させた。 RNA ペレットを 75% エタノールで 2 回洗浄し、風乾してから、RNAse フリーの水に溶解しました。 単離された RNA の濃度と品質は、分光分析 (Nanodrop、Thermo Scientific) によってチェックされました。 1μgの全RNAを、DNase処理(Sigma)後にM-MLV逆転写酵素(Promega)を使用してcDNAに逆転写した。 定量的リアルタイム RT-PCR (qRT-PCR) は、SYBR® Green (BioRad) および CFXConnect リアルタイム PCR 検出システム (BioRad) を使用して実行されました。 結果は、ΔΔCt 法を使用して定量化されました。 まず、アクチン (ACTA; 内皮細胞用) またはリボソームタンパク質側茎サブユニット P0 を使用して、対象遺伝子の閾値 (Ct) を参照遺伝子 Ct 値に対して正規化し、ΔCt 値 (= 対象遺伝子 Ct − 参照遺伝子の Ct) を取得しました。 (RPLP0; 脂肪組織用)。 End.LepR-KO マウスの遺伝子の発現パターンを WT マウスと比較するために、2-ΔΔCt 値を計算し、野生型マウスに対する変化倍数 (= End.LepR-KO の ΔCt / End.LepR の ΔCt-) として表しました。 WT）。 リアルタイム PCR に使用したプライマー配列は次のとおりです。 LepR ショートアイソフォーム: for-GAA GTC TCT CAT GAC CAC TAC AGA TGA および rev-TTG TTT CCC TCC ATC AAA ATG TAA; LepR ロングアイソフォーム: for-GCA TGC AGA ATC AGT GAT ATT TGG および rev-CAA GCT GTA TCG ACA CTG ATT TCT TC; 脂肪酸結合タンパク質-4（Fabp4）：for-GAT GCC TTT GTG GGA ACC TGGおよびrev-TTC ATC GAA TTC CAC GCC CAG。 カテニン ベータ 1 (Ctnnb1): TTA AAC TCC TGC ACC CAC CAT および rev については、AGG GCA AGG TTT CGA ATC AA。 Ccnd1; for：GTT CGT GGC CTC TAA GAT GAA GGA、rev：CAC TTG AGC TTG TTC ACC AGA AGC。 ペリリピン-1 (Plin1): for-CTT TCT CGA CAC ACC ATG CAA ACC および rev-CCA CGT TAT CCG TAA CAC CCT TCA; レプチン（Lep）：for-GGA TCA GGT TTT GTG GTG CTおよびrev-TTG TGG CCC ATA AAG TCC TC; Pdgfra: for - TAT CCT CCC AAA CGA GAA TGA GA および rev - GTG GTT GTA GTA GCA AGT GTA CC; Pparg: for-CTCACAATGCCATCAGGTTTT および rev-CTC TTG CAC GGC TTT CTA CGG; Pref1: for - CGT GAT CAA TGG TTC TCC CT および rev - AGG GGT ACA GCT GTT GGT TG; グルコーストランスポーターメンバー 1 (Glut1): for-GCA GTT CGG CTA TAA CAC TGG および rev-GCG GTG GTT CCA TGT TTG ATT G; またはイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（Idh）：for-GGA GAA GCC GGT AGT GGA GAおよびrev-GGT CTG GTC ACG GTT TGG A; または、サーチュイン-3 (Sirt3): については、ATC CCG GAC TTC AGA TCC CC、および rev は CAA CAT GAA AAA GGG CTT GGG。 Nos3: for-GAC CCT CAC CGC TAC AAC AT および rev-CTG GCC TTC TGC TCA TTT TC; 選択: for-ATG CCT CGC GCT TTC TCT C および rev-GTA GTC CCG CTG ACA GTA TGC; および Vcam1: for - CTT CAT CCC CAC CAT TGA AG および rev - TGA GCA GGT CAG GTT CAC AG。

新たに採取した VAT を氷冷 PBS に移し、細かく刻み、コラゲナーゼ溶液 (RPMI 培地中 1 mg/mL コラゲナーゼ II) 中で 37 °C で 1 時間、一定に振盪しながら消化しました (ThermoMixer® C; Eppendorf)。 1時間後、組織を70μmのセルストレーナー(greiner bio-one)に通して未消化の細胞破片を除去し、FACS緩衝液(1% FBS、2 mM EDTAを含むPBS)で洗浄して脂肪細胞を収集した。 同数の細胞をCD16/CD32に対する非標識モノクローナル抗体(mAb)(eBioscience)とともに10分間インキュベートして、非特異的Fc受容体媒介結合をブロックした。 単球とマクロファージをアロフィコシアニン (APC)-eFluor-780 または BV/11 標識抗マウス CD45 および固定生存率色素 eFluor506、APC 標識抗マウス CD11b、PE 標識抗マウス CD115、PerCP で 30 分間染色しました。 -Cy5.5標識抗マウスLy6C、BV650標識抗マウスCD11c、パシフィックブルー標識抗マウスF4/80、フルオレセインイソチオシアネート標識抗マウスCX3CR1、およびAPC-Cy7標識抗マウス主要組織適合性複合体 (MHC) クラス II。 T 細胞、B 細胞、NK 細胞、および多形核白血球は、PE-Cy7 標識抗 B220、抗 CD3、抗 NK1.1、および Ly6G 抗体 (すべて BioLegend 製) で染色することによって除外されました。 すべてのフローサイトメトリー測定は、BD LSR II (Becton Dickinson、ハイデルベルク、ドイツ) で実行されました。 データ分析には Flow Jo バージョン 10 を使用しました。

定量的データは、平均値 ± 標準偏差として表示されます。 正規分布は、Shapiro-Wilk 正規性検定を使用して検査されました。 2 つのグループ間の差異は、対応のない平均についてはスチューデントの t 検定、または正規分布が確認されない場合はマンホイットニー検定によって検定されました。 3 つ以上のグループを比較する場合、値が正規分布している場合は一元配置または二元配置分散分析 (ANOVA) に続いてシダックの多重比較検定が実行され、そうでない場合はクラスカル・ウォリス検定に続いてダンの多重比較検定が実行されました。 異なる時点での 2 つのグループを比較するために、二元配置分散分析を使用しました。 P が 0.05 未満の値に達した場合、統計的有意性があるとみなされました。 すべての分析は、GraphPad PRISM データ分析ソフトウェア (Windows 用バージョン 9.0、GraphPad Software Inc.) を使用して実行されました。

この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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著者らは、優れた技術支援をいただいたMarina Thielen氏とMichaela Moisch氏（ドイツ、マインツ大学医療センター心臓病科）に感謝したいと思います。 この研究は、ドイツ教育機関 (SCHA 808/7-1 および SCHA808/15-1) およびヘルツ・クライスラウフ・フォルシュングドイツ中央機関 (DZHK Shared-Expertise [SE]-94) によって支援されました。 KS は DZHK (サイト、マインツ、ラインマイン) の主任研究員です。 KZ は、Marie Skłodowska Curie 革新的トレーニング ネットワーク「TICARDIO」からの PhD フェローシップ (助成契約番号 813409) によって支援されています。

Projekt DEAL によって実現および組織されたオープンアクセス資金調達。

ドイツ、マインツ、ヨハネス・グーテンベルク大学マインツ大学医療センター心臓病学教室

ラジニカーント ゴギラージュ、アストリッド ヒューバート、ルイーザ レナー、マグダレナ L. ボチェネク & カトリン シェーファー

マインツ大学医療センター、血栓症および止血センター、マインツ、ドイツ

クラウディウス・ヴィッツラー、ファテメ・シャーネ、マグダレナ・L・ボチェネク、コンスタンティノス・ジフコス、クリスチャン・ベッカー、マドゥスダン・ターティ

ミュンスター大学クリニック皮膚科クリニック、ミュンスター、ドイツ

クリスチャン・ベッカー

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研究の構想と設計: RG、TM、KS。 データ収集・分析：RG、CW、AH、MLB、KZ、FS、LR 原稿原稿執筆・編集：RG、CB、TM、KS

カトリン・シェーファーへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Gogiraju、R.、Witzler、C.、Shahneh、F. 他。 マウスの内皮レプチン受容体の欠失は、食事誘発性の肥満を促進します。 Sci Rep 13、8276 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35281-7

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受信日: 2023 年 1 月 19 日

受理日: 2023 年 5 月 16 日

公開日: 2023 年 5 月 22 日

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